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今天给大家分享的这篇文章是来自巴西佩洛塔斯联邦大学OdirAnt?nioDellagostin教授团队关于猪肺炎支原体嵌合蛋白疫苗的相关研究工作。
猪地方流行性肺炎是由猪肺炎支原体感染引起的一种在集约化养猪业中高度流行的呼吸系统疾病。其临床主要表现为咳嗽、平均日增重率和饲料转化效率降低。由于生产力的下降以及用于治疗该疾病的药物成本较高，因此该病常给世界养猪业造成巨大的经济损失。
疫苗接种是控制猪地方流行性肺炎最常用的策略。目前的商业疫苗主要是灭活的全菌加佐剂疫苗，尽管它们提高了生产性能，但这些疫苗并不能有效的阻止病原体在呼吸道定殖，也无法诱导消除性免疫的发生，因此它们对疾病的防控只提供了部分保护作用。如何开发更有效的疫苗，对于防控猪地方流行性肺炎而言是极为关键的。
一种抗原往往不足以诱导针对猪地方流行性肺炎疾病的理想免疫反应。因此，由多个抗原融合而成的疫苗可能显示出更高的免疫原性。同时有研究表明，全菌制剂显示出较好的免疫调节作用[1]。此外，灭活的全菌制剂还有其他优点，如可以大规模生产同时无需增溶和纯化等步骤，因此生产成本相对较低，而且细菌含有许多刺激抗原提呈细胞的相关因子可进一步放大免疫效应。
因此为了筛选一种克服现有细菌疫苗局限性的替代疫苗，作者采用了反向疫苗学方法以及结合之前的文献报道最终选择将粘附素P97(P97R1)、分子伴侣蛋白DnaK(P42)、外膜蛋白（P95）以及膜表面蛋白（P46）四种抗原组成多抗嵌合蛋白（表1）。并使用自然感染猪的血清验证该复合物的抗原性。随后通过在小鼠模型中检测不同的疫苗配方（表2）（纯化的嵌合蛋白加佐剂疫苗与重组大肠杆菌疫苗），进而评估该嵌合体的免疫原性。
用于构建嵌合蛋白的抗原序列的特征如表1所示。所获得的合成基因被克隆到PAE表达载体(图1A)中。嵌合蛋白的三级结构被预测如图1B所示。随后通过大肠杆菌BL21菌株成功表达了分子量约为62kDa的可溶性重组蛋白。
图1嵌合蛋白构建示意图
在Westernblot分析中，嵌合蛋白可被抗组氨酸的mAb标签抗体所检测识别，同时4个重组蛋白均能与自然感染的阳性血清发生特异性抗体反应(图2A)。在ELISA试验中，不同支原体阳性猪群的血清对该蛋白的识别率均明显高于SPF血清(图2B)。以上结果表明，4个候选蛋白具有良好的抗原性，同时也表明了嵌合蛋白保持了原有的抗原表位。
图2嵌合蛋白的抗原分析
随后作者进行免疫分组（表2），同时用间接ELISA法检测重组疫苗诱导的总特异性抗体(总IgG、IgG1和IgG2a亚型)。结果发现，含有嵌合蛋白的疫苗配方(rCHIadd组和E.colirCHI组)在接种疫苗后第21天诱导的抗体应答相比于阴性对照组(PBSadd组和E.coliVec组)而言显著升高。所有被测抗原的抗体水平在63天内保持稳定(图3)。表明嵌合蛋白依旧保留了其良好的免疫原性。
在接种疫苗后第21-63天中，rCHIAdd佐剂组诱导的抗嵌合蛋白总抗体水平显著高于E.colirCHI组(图3A)。在注射疫苗42和63天后，RCHIAdd组血清中抗P42和抗P95抗体水平显著高于E.colirCHI组(图3C，3D)。然而对于rP46和rP97R1抗原而言，RCHIAdd和E.colirCHI两种疫苗配方组合所产生的抗体均无显著性差异。
所测试的商用疫苗血清（BACT组）无法对rP97R1、rP95和rP42抗原发生免疫中和反应。这可能是用于生产商业疫苗的菌株没有表达相应的这些抗原，或者只是在较低的水平上表达。这也反映出由于一些重要抗原的缺乏从而导致了商业疫苗的免疫效果不甚理想的现象发生。然而有趣的是，BACT组血清自己能单独识别rP46抗原，但当该抗原插入嵌合蛋白时则BACT组血清将无法识别该抗原。这可能是由于嵌合体中的rP46蛋白构象表位可能无法正确折叠，从而阻碍了商品化疫苗诱导的抗体识别。
图3重组蛋白(A-E)ELISA测定小鼠免疫诱导的IgG反应
IgG亚型分析表明，两种疫苗配方(rCHIadd和E.colirCHI组)都能刺激产生混合的IgG1/IgG2a抗体(图4A)。然而，体液免疫应答(IgG1)占据着主导地位（图4A-E)。这也可能暗示着IgG亚类分布在防控猪地方流行性肺炎方面扮演着重要角色。
图4IgG1和IgG2a抗体分析
为了验证诱导的抗体是否具有识别天然蛋白的能力，作者用免疫小鼠血清对猪肺炎支原全菌蛋白进行ELISA和Westernblot检测，试验结果表明两种疫苗配方(rCHIadd和E.colirCHI组)诱导产生的抗体显示出与猪肺炎支原体(、和J株)天然蛋白反应的能力(图5A，B)。然而有趣的是，两种疫苗配方虽然诱导产生的抗体均能检测到粘附素P97（kDa）和DnaK热休克蛋白（65kDa）条带，但却未能检测到与P46和P95天然蛋白相关的条带(分别 6kDa和kDa)。这可能是由于这些蛋白质没有在体外培养的菌株中表达。
图5嵌合蛋白抗体识别菌株天然蛋白的能力分析
综上所述，该研究描述了由猪肺炎支原体四种重要抗原融合而成的重组嵌合蛋白的制备及其免疫学特性。其结果表明，该嵌合蛋白在小鼠中具有良好的免疫原性，因此它可能是一种潜在的猪肺炎支原体候选疫苗。然而该研究仅仅进行了免疫抗体的检测，尚未对疫苗进行相关的动物保护性试验研究，因此在未来的研究中，需要进一步的研究该重组嵌合疫苗对本体动物的保护性。
参考文献：[1]Moreira,C.,daCunha,C.E.P.,Moreira,G.M.S.G.,Mendon?a,M.,Salvarani,F.M.,Moreira,?.N.,Concei??o,F.R.,.Protectivepotentialofre转载请注明：http://www.cdxxls999.com/zlfyff/8108.html
